3.0版本的CRISPR,功能更強大[創新技巧]

【字體: 時間:2016年04月28日 來源:生物通

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  CRISPR-Cas9系統帶來了基因組編輯的飛躍,大大提高了它的精度和效率。它能夠快速實現一些人類疾病的建模,對生物醫學研究產生了重大的影響。當然,CRISPR系統仍在不斷發展。最近,Jackson Laboratory的Albert Cheng和Mark Wanner就介紹了它的最新進展。

CRISPR-Cas9系統帶來了基因組編輯的飛躍,大大提高了它的精度和效率。它能夠快速實現一些人類疾病的建模,對生物醫學研究產生了重大的影響。當然,CRISPR系統仍在不斷發展。最近,Jackson Laboratory的Albert Cheng和Mark Wanner就介紹了它的最新進展。

CRISPR-Cas9最初只能實現剪切和粘貼的功能,就像早期的智能手機。之后,Cas9核酸酶升級到2.0版本,也就是核酸酶失活的Cas9(dCas9)。dCas9不再切割DNA,但仍然在向導RNA的作用下與基因組序列結合。這時,它就像更高級的智能手機。dCas9可與不同的效應蛋白結合,介導基因調控、編輯等功能。不過,CRISPR 2.0的不足之處在于它每次只能執行一種功能。

Casilio系統

盡管CRISPR 2.0已被證明對研究很有用,但基因不是獨立運作的,研究基因網絡和復雜疾病需要更強大的功能。如今,3.0版本CRISPR,即Casilio,應運而生。這是一個功能強大的平臺,讓CRISPR/Cas9可執行多個任務,輕松實現新的功能。它就像一部新款的智能手機,可同時運行多個應用程序,并不斷安裝新的程序。

Casilio是指CRISPR-dCas9和效應蛋白與可編程的Pumilio(PUF)RNA結合蛋白相融合。RUF結構域含有8序列重復,這些可以編程,改變兩個特定的氨基酸殘基,即可識別4種RNA堿基中的1種。有了Casilio,dCas9就好像一個夾鉗,讓gRNA定位到你感興趣的基因組區域。利用單個dCas9和一個可擴展的Casilio模塊(效應蛋白與PUF蛋白的融合蛋白)庫,Casilio可實現多種功能。

(圖片來自Addgene)

Casilio所需的組件包括dCas9、至少一個sgRNA-PBS,以及Casilio模塊。sgRNA-PBS作為帶有一個或多個Pumilio結合位點的向導RNA,起了關鍵的作用。Addgene目前提供了多個模塊,包括基因激活、基因抑制、染色體標記(熒光)、組蛋白乙酰轉移酶模塊等。

Casilio的應用

利用Casilio,研究人員能夠通過單個向導RNA招募多個效應蛋白。在他們發表的文章中,Casilio能夠多重利用PUF牽引著的效應蛋白,在多個位點同時實現精確的基因組操作。他們同時激活了OCT4,并抑制了SOX2。他們還證明了端粒和中心粒的雙色標記。

另一個強大的應用就是蛋白復合物的組裝。這讓研究人員能夠研究基因調控所涉及到的復合物。利用帶有不同類型Pumilio結合位點的sgRNA,人們可以研究復合物中含有或不含特定組分的影響。也許還能研究化學計量對復合物功能的重要性,如招募x個組分A的分子 vs. y個組分B的分子。

目前Casilio表達載體只能用于瞬時轉染,但研究人員也提供含有Casilio模塊的Gateway供體質粒。這些可與Gateway兼容的其他載體共同使用。他們也在開發慢病毒表達載體,以便將Casilio導入其他類型的細胞。(生物通 薄荷)

原文檢索

Casilio: a versatile CRISPR-Cas9-Pumilio hybrid for gene regulation and genomic labeling

Cell Research (2016) 26:254–257. doi:10.1038/cr.2016.3

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